Inesperado contratiempo para las terapias génicas basadas en CRISPR

Estructura cristalina deducida de la proteína Cas9 (en azul), alrededor de una molécula de ADN (en amarillo) y formando complejo con una molécula de ARN guía (en rojo). Crédito de la imágen: Bang Wong, Broad Institute of Harvard and MIT, Cambridge, MA, USA.
Estructura cristalina deducida de la proteína Cas9 (en azul), alrededor de una molécula de ADN (en amarillo) y formando complejo con una molécula de ARN guía (en rojo). Crédito de la imágen: Bang Wong, Broad Institute of Harvard and MIT, Cambridge, MA, USA.

La revolución biomédica desatada por las herramientas CRISPR de edición genética ha generado también una enorme expectativa frente a la previsible utilización de las mismas en estrategias innovadoras terapéuticas, en nuevas terapias génicas somáticas, esto es, en individuos nacidos, adultos, afectados por algún desorden congénito. Sin embargo, un artículo reciente del laboratorio de Matthew H. Porteus (Universidad de Stanford) acaba de detectar, en la sangre de personas, células del sistema inmune y anticuerpos específicos contra un componente esencial de las herramientas CRISPR, la proteína Cas9. Este contratiempo inesperado deberá tenerse muy en cuenta antes de saltar a la utilización efectiva de las herramientas CRISPR en terapias génicas para pacientes de enfermedades congénitas.

Las herramientas CRISPR, que derivan de las bacterias y que fueron descubiertas por Francis Mojica, microbiólogo de la Universidad de Alicante, se han usado para editar genes a voluntad en múltiples organismos. Por ejemplo para incorporar alteraciones genéticas específicas en animales de laboratorio, en ratones, y estudiar el efecto de las mismas mutaciones en los mismos genes tras el diagnóstico genético de los pacientes de alguna enfermedad con base genética. Son los llamados ratones avatar. Obviamente, si es posible usar las herramientas CRISPR para incorporar mutaciones también pueden usarse para corregirlas. Desde principios de 2016 conocemos ya el éxito de múltiples experimentos pre-clínicos (en animales, no en personas) en los que usando ratones o ratas modelo de alguna enfermedad congénita y la administración de los componentes del sistema CRISPR de edición genética ha sido posible revertir las mutaciones en genes específicos en un porcentaje significativo de las células del órgano afectado. Estos experimentos pioneros han suscitado, lógicamente, una extraordinaria esperanza entre los millones de pacientes afectados de alguna enfermedad congénita, para los cuales no hay ningún tratamiento actualmente disponible.

Las herramientas CRISPR se suelen representar como unas tijeras moleculares. El componente principal es la proteína Cas9, una enzima endonucleasa que corta un gen (ADN) determinado guiada por una pequeña molécula de ARN, de ahí que sean unas tijeras programables. Hace un par de meses pudimos observar imágenes microscópicas de la proteína Cas9 cortando específicamente un gen. El corte específico en el ADN pone en marcha los sistemas de reparación de la célula que serán los encargados de generar una mutación en el lugar del corte o utilizar un ADN molde aportado para substituir y corregir la mutación pre-existente. La proteína Cas9 es una molécula de gran tamaño (1368 aminoacidos), con múltiples dominios y funciones. Habitualmente se utilizan dos proteínas Cas9, derivadas de las bacterias patógenas Streptococcus pyogenes (SpCas9) o Staphylococcus aureus (SaCas9). Esta última (SaCas9) es más pequeña (1053 aminoácidos) y, por ello, es la preferida para aplicaciones terapéuticas, pues el gen que la codifica cabe en los vectores derivados de virus adeno-asociados (AAV) usados en terapia génica. Ambas bacterias son muy comunes y están presentes, a veces sin necesidad de producir una infección, en muchas personas. S. pyogenes puede causar faringitis, otitis, mastitis y otras infecciones en la piel. S. aureus puede causar infecciones graves y aparece regularmente asociada como la causante de muchas infecciones nosocomiales (hospitalarias).

Sabíamos de la inmunogenicidad de la proteína Cas9, su capacidad para suscitar una respuesta del sistema inmunológico, como uno de los problemas a tener en cuenta para su uso en terapia. En concreto, si el tratamiento terapéutico requiere la administración repetida de Cas9 en pacientes puede producirse una reacción inmune a partir de la segunda exposición a Cas9 que comprometa su efectividad y ponga en peligro la vida del paciente a tratar. Pero lo que no sabíamos es que un número importante de personas son portadoras ya en su sangre de anticuerpos y células del sistema inmune dirigidas contra la proteína Cas9. Este es el resultado inesperado que nos ofrece el estudio del laboratorio de Porteus.

Los resultados obtenidos por Porteus no dejan lugar a dudas. En el suero del 79% de las personas testadas lograron identificar la presencia de anticuerpos específicos anti SaCas9. Porcentaje que se reduce al 65% en el caso de SpCas9. Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B y constituyen la denominada inmunidad humoral. En relación a las células del sistema inmune encargadas de la inmunidad celular (los linfocitos T) estos investigadores encuentran linfocitos T específicos anti-SaCas9 en la sangre circulante de 46% de los donantes testados.

Sin embargo, no son capaces de detectar linfocitos T anti-SpCas9, aunque argumentan que puede ser debido a la sensibilidad del método empleado y no pueden descartar que no los haya. Los números de donantes analizados no son muy altos: 22 donantes de sangre y 12 adultos sanos que aportaron sangre circulante, pero los resultados obtenidos son claros, y los porcentajes reportados podrían ser una aproximación al porcentaje real de inmunidad frente a Cas9 existente en la población en general, lo cual obliga a reconsiderar las próximas estrategias terapéuticas basadas en componentes CRISPR.

¿Cómo puede ser esto? Parece que nuestra habitual interacción, infecciosa o no, con estas bacterias patógenas ha hecho que nuestro sistema inmune haya tenido la oportunidad de estar expuesto a las proteínas de estos microorganismos, incluida por supuesto la endonucleasa Cas9 que nos ocupa, y, por ello, haya podido desarrollar en muchos casos una respuesta inmune contra ella.

Como dice Porteus en su artículo, la existencia de anticuerpos anti-Cas9 puede que no sea un problema tan grave, teniendo en cuenta que las estrategias terapéuticas actuales no exponen la Cas9 directamente al torrente sanguíneo, sino que trasladan el gen que codifica para Cas9 dentro de una cápside viral de AAV que vierte sus contenidos dentro de la célula diana, o la reparten conjugada con nanopartículas, no distribuida como una proteína aislada en el torrente sanguineo. Y, además, en los ensayos clínicos de terapia génica, si los pacientes tuvieran inmunidad frente alguno de los componentes administrados (como la Cas9 o las partículas virales AAV) serían excluidos del ensayo.

El problema principal parece ser la inmunidad celular, la existencia de linfocitos T anti-Cas9, de los dos tipos CD4+ (colaboradores) y CD8+ (supresores), por su potencial para generar una fuerte respuesta inflamatoria, con la producción asociada de citoquinas como IFN-gamma o TFN-alfa. La existencia de estas células T anti-Cas9 en la sangre de personas eliminaría cualquier célula que hubiera incorporado la proteína Cas9 (cualquier célula que habría sido editada genéticamente) debido a que fragmentos/péptidos derivados de la proteína Cas9 podrían presentarse al sistema inmune en la superficie de las células editadas a través del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I.

Esto inactivaría de inmediato los beneficios esperados de la estrategia de terapia génica. Además, esto sería un problema particularmente grave en aquellas estrategias basadas en el uso de partículas virales AAV, que utilizan la expresión constante de construcciones génicas de Cas9, y que, más allá de transducir preferentemente las células seleccionadas, y debido a la falta de específidad absoluta de los serotipos AAV usados, acabarían también transduciendo otras células, como las del hígado, normalmente. La presentación de péptidos Cas9 a través de MHC clase I en la superficie de hepatocitos transducidos reactivaría los linfocitos T anti-Cas9 y desataría una respuesta inflamatoria sistémica de consecuencias imprevisibles, y nada beneficiosas para el paciente tratado. Esto obligaría al uso de estrategias de inmunosupresión o disminución de la respuesta del sistema inmune tras estos tratamientos, y comprometería la seguridad y la eficacia de los mismos.

Deberemos estar atentos a estudios posteriores que puedan confirmar estas observaciones en un número mayor de personas analizadas, pero está claro que estamos ante un inesperado contratiempo para las terapias génicas basadas en el sistema CRISPR (en la proteína Cas9) que habrá que tener muy en cuenta antes de lanzar su utilización terapéutica en posibles pacientes.


18 Comentarios

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Lluis Montoliu

Como me sugiere por twitter mi colega-colaborador de Naukas Ignacio López-Goñi (@microBIOblog) una posible solución a este contratiempo pasaría por utilizar otras proteínas Cas9, o análogas, de otras bacterias. En efecto, probablemente tenemos una relación demasiado próxima con las bacterias patógenas Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus, lo cual haya causado que nuestro cuerpo haya aprendido a defenderse de sus proteínas, también la Cas9 que ahora usamos para terapia génica. Gracias a los microbiólogos como Ignacio López-Goñi y Francis Mojica, que las descubrió en arqueas, sabemos que aproximadamente un 50% de las bacterias y un 90% de las arqueas poseen sistemas de defensa CRISPR, la gran mayoría de ellos todavía por identificar y por caracterizarse. Entre las proteínas análogas a Cas9 que ya conocemos, de otras bacterias, que tienen la misma capacidad de generar un corte específico en el ADN tenemos a la proteína Cpf1, que podría utilizarse también en desarrollos terapéuticos. Realmente este es un campo en evolución y explosión de conocimiento constantes.

Claudio HidalgoClaudio Hidalgo

Efectivamente hay muchas otras bacterias que también disponen de sistenas CRISPR con endonucleasa Cas9 y son bacterias comensales del microbioma humano, como bifidobacterias y lactobacilos, y no patógenos. El uso generalizado de Cas9 de un patógeno, sea SpyCas9 o SaCas9, se debe simplemente a que han sido las primeras en caracterizarse pero no son las únicas ni las mejores. Los problemas de patentes, el origen de SpyCas9 de un patógeno y la existencias de efectos indeseados (off targets) están dando paso a la búsqueda y al desarrollo de nuevas nucleasas más efectivas.

gabriela

En realidad cae de cajón que si nuestro sistema inmune reconoce a una bacteria o parte de ella, la atacará! Yo supongo que no eran bacterias conocidas por los organismos de los ratones, y por eso la cosa andaba bien, pero al trasladar eso al humano aparecía el sistema defensivo en patota atacando!

Las personas que padecen enfermedades raras están expectantes y rogando no haya estos retrocesos.

Lluis Montoliu

Gracias Claudio y Gabriela por vuestros comentarios. En efecto, nuestro cuerpo está acostumbrado a defenderse de S.aureus y S.pyogenes, pero estas fueron las Cas9 que primero se caracterizaron. Hay literalmente centenares de miles sino millones de especies de bacterias y arqueas todavía por investigar y caracterizar, donde surgirán las próximas proteínas análogas a Cas9, que realicen una función parecida pero sin ser conocidas por nuestro sistema inmune. Lo que sucede es que la SpCas9 es un prodigio de síntesis y perfección evolutiva. Como he aprendido escuchando y leyendo a Francis Mojica, muchas bacterias y arqueas no tienen solamente una proteína Cas9 que realiza todas las funciones sino que estas las realizan diversas proteínas Cas, que le permiten al microorganismo ser más maleable y adaptarse al medio ambiente cambiante. S.pyogenes es un patógeno intracelular cuyo medio ambiente es relativamente constante y puede permitirse el lujo de adoptar una estrategia evolutiva más compacta, todas las funciones en una sola proteína. Al ser solamente una proteína la necesaria es fácil de exportar el sistema para la edición genética. Si se necesitarán cinco, seis o más proteínas el sistema se tornaría muy complejo para su uso en terapias. Hay que seguir investigando otras proteínas Cas9 o parecidas de microorganismos con los que los humanos no hayamos interaccionado.

Lluis Montoliu

Por cierto, Mat Porteus (Stanford University), responsable de este estudio que hoy comento en esta entrada de Naukas, será uno de los investigadores invitados que tendremos a finales de mes en el Simposio Internacional de la Fundación Ramón Areces que organizamos sobre edición genética y enfermedades raras. Será en la sede de la Fundación, en Madrid, los días 25 y 26 de Enero. Asistencia gratuita hasta completar aforo. Hay que registrarse en la web de la fundación: http://www.fundacionareces.es/fundac...velAgenda=2

secretsecret

Ya me imagino al VIH-activo o SIDA haciedo a algunas personas un CRISPR una operacion genetica realmente despiadada.

Eduardo Setti

Wikipedia dice que el que descubrió el CRISPR fue Y. Ishino en el año 1987. Si no es así habría que notificar a los administradores de Wiki.

Lluis Montoliu

Eduardo, Ishino fue efectivamente quien describio unas repeticiones en el genoma de E.coli (una bacteria gram negativa) en 1987 por vez primera, que luego otros investigadores holandeses las descubrieron en 1991 en Mycobacterium (una bacteria gram +) y finalmente Francis Mojica fue quien las descubrio en arqueas, y el unico de los tres equipos que siguió trabajando hasta interpretar correctamente que se trataba de parte de un sistema inmune de defensa de procariotas, publicandolo en 2005, de ahi que el descubridor del sistema CRISPR sea Francis Mojica. Lo contamos en este articulo: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27401123

VíctorVíctor

Había visto la noticia en Xataka y me pareció demasiado catastrofista.Así que decidí buscar en Google para ver si encontraba algún otro artículo donde explicará algo más en profundidad lo que se había descubierto.

Muy buen post,gracias.

Manada PerezManada Perez

La figura 1 la va a coger un revisor decente y la va a destrozar. Solo diluyen el suero 1:10. Con esa cantidad de anticuerpos la union que muestran puede ser totalmente inespecifica!!
Y la figura suplementaria 1 (donde intentan demostrar que la union en la figura 1 es especifica) es de risa! Solo muestran dos muestras que no se pueden relacionar con la figura 1 y en una de las muestras solo con un homologo de Cas9.
Por el amor de Ramon y Cajal! No hay quien se crea el articulo (al menos como esta ahora). Obviamente el sistema immune va a desarrollar anticuerpos frente a las proteinas Cas9 una vez se utilice la terapia genica por primera vez. Pero no hay motivo para creer que hay anticuerpos “preeexistentes” frente a Cas9. Igual que no hay anticuerpos preexistentes contra el virus de la hepatitis, el sida o culaquier otra infeccion…

RoldanRoldan

Quizás usando otras cas o modificando la cas9 sin perder funcionalidad pero perdiendo la inmunogeneicidad (si esto es posible).

¿Y no podría tener esto una aplicacion contra el cáncer? Buscas editar las celulas cancerosas, por ejemplo usando como target algun supresor tumoral dañado (mutado).

Y como extra la célula tumoral queda marcada como bacteriana para el sistema inmune…
La célula cancerosa suele tener mecanismos de defensa contra el sistema inmune, con lo cual la respuesta puede ser más suave y se podría modular con inmunoterapia.

Manada PerezManada Perez

Tu primer parrafo es justo lo que acaba de salir hoy: https://www.biorxiv.org/content/earl...1/10/245985
Lo del cancer, no lo veo. El problema es el delivery (igual que con el resto de tratamientos antitumorales). Como haces que CRISPR vaya solo a las celulas cancerosas y no a las normales? Si resuelves ese problema mejor mandarle a las celulas cancerosas (especificamente) otras cosas mas potentes.

RoldanRoldan

Yo pensaba que solo las células editadas presentan trozos de cas9 en la superficie. Es algo que pone en el artículo. Como solo editas la que tienen un supresor tumoral clave mutado las sanas no lo van a presentar. (o se podría buscar otra diana, pero lo del supresor es interesante porque restauras en teoría la via apoptosica natural y es potencialmente selectivo de células sanas).

“La existencia de estas células T anti-Cas9 en la sangre de personas eliminaría cualquier célula que hubiera incorporado la proteína Cas9 (cualquier célula que habría sido editada genéticamente) debido a que fragmentos/péptidos derivados de la proteína Cas9 podrían presentarse al sistema inmune en la superficie de las células editadas a través del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I”

También creo que se ha avanzado mucho en el delivery de fármacos, gracias a la nanotecnologia, así que por ahi tambien se podría mejorar la eficiencia del delivery.

FernandoFernando

Si, solo las celulas editadas presentan partes de Cas9. Pero, de momento, no se sabe como hacer que Cas9 solo vaya a celulas tumorales y no sanas.
El “delivery” es el problema de lo que propones y hay mucha investigacion en marcha para solucionarlo (y no solo con celulas tumorales, pero para poder mandar Cas9 a tejidos especificos sin que llegue a otros no deseados).

Manada PerezManada Perez

Que peligro tienen los preprints. No se si llegara a publicarse, pero el dano ya esta hecho.
Ahora va a resultar que todo el que haya comido cabrales o roquefort va a tener anticuerpos frente a la penicilina poque los quesos azules se hacen con miembros del genero penicillium. O anticuerpos frente a los lactobacilos por comer yogurt.
Si lo miras a traves de Western Blot usando 1mg de anticuerpos policlonales de suero, seguro que te sale positivo!

Manada PerezManada Perez

La hepatitis C es un ejemplo clarificador de por que’ el metodo de Western Blot no es el adecuado para saber si hay anticuerpos frente a cualquier antigeno. Si un medico quiere saber si estas (o has sido) afectado por el virus de la Hepatitis C, toman un poco de sangre y se analizan los anticuerpos presentes. Como se hace? Con el tipico ELISA o con el CLIA (que es bastante parecido en el fondo pero produce una senal distinta: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/art...PMC3943138/).
Ademas de utilizar un metodo mas especifico que el Western usado por el grupo de Porteus, las diluciones del suero van desde 1:100 (que puede dar falsos positivos) a 1:100000. https://academic.oup.com/jid/article...1/53/796428
Con Cas9 no solo se ha utlizado un metodo erroneo (que proporciona falsos positivos) si no que ademas se han utilizado concentraciones de anticuerpos tan altas que los resultados son muy probablemente debido a falsos positivos.
Un camelo.

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