Las sorprendentes CRISPR y sus aplicaciones en diagnóstico

Nuevas aplicaciones para las herramientas CRISPR en diagnóstico desarrolladas por los laboratorios de Jennifer Doudna (Stanford Univ, CA, USA) y de Feng Zhang (BROAD, Cambridge, MA, USA) publicadas en sendos artículos en Science. Ilustración modificada a partir de la figura 4 (de J. S. Chen et al., Science 10.1126/science.aar6245, 2018) y la figura 1 (de J. S. Gootenberg et al., Science 10.1126/science.aaq0179, 2018)
Nuevas aplicaciones para las herramientas CRISPR en diagnóstico desarrolladas por los laboratorios de Jennifer Doudna (Berkeley Univ, CA, USA) y de Feng Zhang (BROAD, Cambridge, MA, USA) publicadas en sendos artículos en Science. Ilustración modificada a partir de la figura 4 (de J. S. Chen et al., Science 10.1126/science.aar6245, 2018) y la figura 1 (de J. S. Gootenberg et al., Science 10.1126/science.aaq0179, 2018)

Las herramientas CRISPR son un pozo infinito de sorpresas. El sistema CRISPR, que fue inicialmente identificado como uno de los sistemas de defensa de las bacterias por el microbiólogo español Francisco J. Martínez Mojica, y posteriormente adaptado como una herramienta para la edición genética de cualquier genoma, ahora sigue sorprendiéndonos con las nuevas aplicaciones en diagnóstico, que acabamos de conocer, desarrolladas por los laboratorios de Jennifer Doudna (Berkeley Univ., CA, USA) y de Feng Zhang (BROAD, Cambridge, MA, USA), publicadas en sendos artículos en la revista científica Science.

El sistema canónico CRISPR que utilizamos los investigadores para editar genes esencialmente está formado por dos elementos: una proteína que corta el ADN, una endonucleasa (habitualmente la proteína Cas9 de la bacteria Streptococcus pyogenes), y una pequeña molécula de ARN que se aparea específicamente con la secuencia del gen a editar y que actúa como guía, para indicarle a la nucleasa Cas9 dónde debe cortar. Luego este corte preciso en el ADN se repara en las células, pudiendo dar lugar a una mutación (y entonces el gen deja de funcionar),  o a una edición a voluntad (a partir de un ADN molde que se le puede ofrecer adicionalmente al sistema), y entonces decimos que la secuencia la hemos editado, por ejemplo corrigiendo una mutación pre-existente.

Existen muchos tipos de proteínas parecidas a la endonucleasa Cas9, probablemente tantos como bacterias hay que usen el sistema CRISPR para defenderse de los virus que las acechan. Los microbiólogos moleculares andan a la búsqueda de nuevas proteínas Cas (del inglés CRISPR associated protein) que puedan tener propiedades singulares y aprovechables biotecnológicamente. El laboratorio de Feng Zhang ha liderado la descripción de bastantes de estas nuevas proteínas Cas, como por ejemplo: la proteína Cpf1 (ahora llamada Cas12a), la proteína Cas9 de Staphylococcus aureus, la proteína Cas13a o la proteína Cas13b, entre otras.

El año pasado, el laboratorio de Feng Zhang anduvo caracterizando la actividad de la proteína Cas13a, que en lugar de cortar ADN de doble cadena corta ARN de cadena sencilla, guiada por una pequeña molécula de ARN también. Recordemos que el ARN (de cadena sencilla) deriva, mediante transcripción, del ADN del genoma (que es una doble cadena). Y se percató que tras localizar y cortar el ARN complementario a la secuencia del ARN guía la proteína Cas13a enloquecía y empezaba a cortar indiscriminada e inespecíficamente todas las moléculas de ARN que encontraba a su paso. Este resultado inesperado, e inespecífico, hubiera probablemente decepcionado y desinteresado a muchos investigadores. Sin embargo Feng Zhang lo adaptó, incluyendo pequeñas moléculas de ARN capaces de brillar, de convertirse en fluorescentes, al ser cortadas, y lo acabo convirtiendo en un innovador sistema de diagnóstico con una altísima sensibilidad, al que denominó SHERLOCK (del inglés, Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing).

Ahora el laboratorio de Feng Zhang nos trae la segunda versión del sistema de diagnóstico: SHERLOCKv2, en la que han logrado multiplexar (combinar el diagnóstico simultáneo de diferentes agentes infecciosos en un solo tubo, en una misma reacción) hasta cuatro proteínas Cas de diferentes bacterias (una Cas12a, una Cas13a y dos Cas13b). Estas proteínas Cas tienen una preferencia de corte inespecífico por ARN (Cas13a y Cas13b) o ADN (Cas12a) de cadena sencilla tras localizar la secuencia homóloga a la guía utilizada. En el mismo tubo añadieron secuencias características de corte preferente para cada proteína, una vez activada, uniendo dichas moléculas a compuestos fluorescentes de distintos colores, que brillan al ser cortados. Este ingenioso truco les ha valido para desarrollar un sistema de diagnóstico combinado para el virus Zika, el virus causante del Dengue, y otras mutaciones en genes relevantes en patologías. Hasta cuatro agentes infecciosos o cuatro mutaciones diagnosticadas a la vez. Y con una sensibilidad del orden de 2 aM (attoMolar, 10exp-18, ~2 trillonésimas de mol).

De manera independiente, el laboratorio de Jennifer Doudna, ha llegado a conclusiones similares usando solamente la proteína Ca12a (Cpf1 anteriormente). Ellos también se percataron que esta proteína Cas12a, que en principio corta ADN de doble cadena guiada por una molécula de ARN complementaria al gen que se desea editar, una vez ha localizado el gen diana y lo ha cortado también enloquece, y sigue cortando por doquier cualquier ADN de cadena sencilla que haya en la muestra a analizar. De nuevo la propuesta de este laboratorio es incluir en la muestra a analizar moléculas de ADN de cadena sencilla indicadoras, unidas a compuestos fluorescentes, que empiezan a brillar al ser digeridas por la proteína Cas12a activada. La detección de la fluorescencia confirma que la proteína Cas12a cortó, en primera instancia, en el gen problema (o que detectó su presencia). Por lo tanto el brillo en la muestra es un chivato del evento inicial, y esta actividad inespecífica de la proteína Cas12 se convierte en un sistema de diagnóstico muy sensible, que los autores denominan DETECTR (del inglés DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) y aplican para detectar la presencia del virus del papiloma humano (HPV) en muestras humanas. En ambos casos, tanto en SHERLOCKv2 como en DETECTR, la muestra original es amplificada en condiciones isotérmicas (a +37ºC), para aumentar la sensibilidad del método y el número de moléculas que la proteína Cas12a puede detectar como complementarias al ARN guía, y que necesita para activarse y ser útil como herramienta de diagnóstico.

En resumen, las herramientas CRISPR no solamente sirven para editar genes sino que también pueden servir para detectarlos. Sorprendente.

Barcelona (1963). Biólogo de educación, genetista de formación y biotecnólogo de profesión. He trabajado en Barcelona, Heidelberg y, desde 1997, en Madrid. Investigador científico del CSIC en el Centro Nacional de Biotecnología (CNB), investigador del CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER-ISCIII). Utilizo modelos animales modificados y editados genéticamente, con las herramientas CRISPR, para entender y desarrollar posibles terapias para el albinismo. Además de la investigación, me apasiona la bioética y la divulgación.



Por Lluis Montoliu
Publicado el ⌚ 15 febrero, 2018
Categoría(s): ✓ Biología • Ciencia • Divulgación • Medicina
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