El Alcatraz de las bacterias

Las bacterias tienen comportamiento social, no son simples máquinas reproductivas. Se comunican, forman comunidades resistentes a los antibióticos, biopelículas, y coordinan actividades en grupo a través del quorum sensing (QS). El descubrimiento de estos aspectos ha dado lugar al nacimiento de la «sociomicrobiología.»

Para indagar en el estudio del comportamiento de las bacterias se hacía necesario el estudio in vivo de pequeñas comunidades bacterianas en un entorno que pudiese ser manipulado con relativa facilidad. Se intentó con volúmenes ultra reducidos de bacterias, pero estos no permitían muchos procesos impidiendo el correcto crecimiento celular. Luego se intentó con técnicas donde se atrapaban las bacterias, sin embargo el estar atrapadas les impedía formar estructuras en tres dimensiones, al no poder organizarse no se podían observar muchos comportamientos relacionados con las biopelículas.

Pero parece que un grupo de investigadores de la Universidad de Texas, ha dado con la solución al problema. Han diseñado unas trampas microscópicas a modo de pequeñas nasas. Están fabricadas de tal manera una vez tengan dentro a la bacteria, se puedan cerrar pero permitan la transferencia eficaz, tanto de nutrientes como de productos de desecho y otras pequeñas moléculas. Lo que permite a la bacteria crecer dentro de su prisión mientras la observamos y controlamos el medio que la rodea.

Distintos tipos de trampas/nasas bacterianas
Típica nasa de pesca o muestreo

¿Cómo se construyeron estas estructuras?

Las trampas se fabricaron usando albúmina de suero bovino como materia prima. El proceso empezaría situando una solución de estas proteínas sobre la superficie donde se quiere construir y, a continuación se haría incidir un láser sobre la misma, que provocará la formación de enlaces covalentes entre aminoácidos de distintas moléculas de albúmina uniéndolas entre sí y formando una estructura más o menos sólida. El haz de láser está concentrado en un punto y sólo ahí tendrá la intensidad requerida para crear suficientes de estos enlaces, de modo que se puede realizar la construcción a base de ir eligiendo en qué lugares del espacio tridimensional se dispara, solidificando el material punto a punto. La trampa se construye creando planos horizontales sucesivos —cada uno con una sección transversal de lo que será la estructura final—, y para hacer cada plano se hace un barrido de la superficie con el láser línea a línea.

Sin embargo, para hacer esto no queremos que el láser esté activo durante todo el barrido (porque se solidificaría todo el plano) sino que sólo sea disparado en los puntos que nos interesan, por lo que hay que hallar una forma de que sólo llegue luz a estos lugares. El truco está en que en el recorrido del láser en el sistema óptico hay un dispositivo electrónico en el que éste tiene que reflejarse, consistente en un pequeño espejo o pantalla en la que se puede controlar digitalmente si en cada punto el láser se reflejará o será absorbido, de modo que el patrón que aparezca en este dispositivo será reproducido en un plano de la estructura de albúmina. Una vez se ha terminado con uno de los planos horizontales, se cambia el patrón en el dispositivo reflectante (digital micromirror device, abreviado DMD en la primera imagen), el foco donde se concentra el láser en la albúmina se desplaza en vertical media micra, y se repite el proceso con la siguiente capa.

Como curiosidad, aquí una muestra de la complejidad de las estructuras que se pueden conseguir con este método:

las barras blancas miden 10 micras

Para realizar el experimento, primero los investigadores pusieron a prueba las nasas microbianas, para ello comprobaron si la tasa de crecimiento dentro de las mismas era igual a la existente en crecimiento  libre o en otros sistemas, como el peritoneo de ratas. Las pruebas mostraron que el crecimiento era casi idéntico en todos los sistemas. El flujo conseguía llevar nutrientes a el interior de la prisión y arrastrar los productos de desecho, manteniendo viables a las bacterias que se encontraban dentro. La forma de la prisión tampoco pareció influir demasiado.

http://www.youtube.com/watch?v=Rk04_GEZFiQ

Para evaluar si las moléculas pequeñas podían pasar por las «rejas» de la prisión, se usó un derivado fluorescente del antibiótico gentamicina, perfundiendo el mismo a través del flujo. En pocos segundos alcanzó el interior de la prisión, esto confirmó que la misma era permeable a las pequeñas moléculas biológicamente relevantes. Por último se comprobó si una prisión llena hasta los topes podría impedir el paso de estas pequeñas moléculas. Para ellos se observó el tiempo que tardaban en ocupar la concentración deseada las moléculas tanto en una prisión vacía, cono en una llena. Según los datos este tiempo fue de aproximadamente 1 segundo de diferencia, lo que demostró que las células agrupadas no suponían una barrera impenetrable para la difusión de pequeñas moléculas.

Para evitar que las bacterias escapasen de las trampas una vez dentro, a los investigadores les resultó útil averiguar que la albúmina de las estructuras se expandía de forma irreversible al aumentar la temperatura. De este modo, calentando las trampas a unos 37 °C cuando las bacterias estaban dentro, se cierra la estrecha entrada cuando las paredes se expanden

El tamaño de la población y su influencia sobre el QS (quorum sensing, sistema social bacteriano) era algo que había que comprobar también. Según las teorías más aceptadas al QS el único factor que le afecta es la densidad de la población, y por lo tanto es el número de bacterias la única variable  reguladora de las actividades sociales.

Sin embargo, existen otras hipótesis sobre factores que afectan al QS. Una de ellas es el modelo de eficiencia en la detección, el cual afirma que las bacterias no sólo producen moléculas moduladoras del QS a la hora de sensar el número de individuos. Sino que además lo hacen para evaluar el espacio, el tamaño de la población y las tasas de transferencia de sustancias que pasan por su medio ambiente.

Hasta el momento no existía forma alguna de comprobar esta hipótesis, sin embargo gracias a las nasas microbianas la cosa ha cambiado…

Para poner a prueba la hipótesis los investigadores encerraron en las trampas una cepa de Pseudomonas aeruginosa que contenían un gen codificante para una GFP* asociada al promotor de actividad QS, esto hacía que la bacteria diese “color verde” cuando usaba sus genes QS, o en otras palabras, la bacteria producía un brillo verde al tener actividad social.

Se comprobó que el número de células era un parámetro fundamental, como ya se sabía… Sin embargo gracias a las nasas/trampas el experimento se pudo llevar al siguiente nivel, el de la detección de tasa de flujo. Para ello se redujo el flujo y con ello el paso de materia a través de la nasa, lo que hizo que los genes asociados a QS se expresaran hasta 6 veces más. Con esto se demostró que la tasa de transferencia de masa es un factor tan importante como el número de células, ¡siendo ambos capaces de modular la percepción de quórum!

Podemos observar la expresión de GFP tras un tiempo de incubación frente a un flujo reducido de materia

Otra cuestión a resolver era la expresión de resistencia a antibióticos en pequeñas poblaciones. Gracias a que las nasas son porosas, se pudo hacer pasar antibióticos y estudiar los resultados. Para ello se estudiaron dos nasas, una con una alta densidad celular (aproximadamente 225 bacterias) y otra con baja densidad (aproximadamente 20 bacterias) y se las trató durante 2 horas con el antibiótico gentamicina. A esta densidad las trampas no están llenas al máximo así que la tendencia es a seguir creciendo, la sorpresa llegó cuando se observó una mortalidad del 77% en la nasa con baja densidad celular frente al 3% de muertes en la prisión de alta densidad. La susceptibilidad a los antibióticos parece estar causada por cambios del fenotipo, que ocurren seguramente debido a diferencias de densidad celular y no por tasa de flujo. Este hallazgo plantea preguntas importantes sobre la necesidad o no de una biopelícula para iniciar resistencia a antibióticos.

Dos cárceles donde se puede observar lo explicado en el párrafo anterior, mortalidad a un antibiótico frente a densidad celular

Las nasas microbianas nos ofrecen una nueva perspectiva para estudiar el comportamiento de las bacterias en grupos controlados, lo cual permitirá comprobar las respuestas genotípicas y fenotípicas de las mismas. Se podrá experimentar desde individualmente a pequeños grupos a una alta densidad; y seguramente en el futuro esta herramienta sirva para esclarecer numerosos interrogantes relacionados con la sociomicrobiología.

Y recuerda…si eres una inteligente  P. aeruginosas que lee blogs de divulgación científica…

*Las GFP (green fluorescent protein) son proteínas verdes fluorescentes usadas para señalar presencia de moléculas no visibles. El gen que codifica esta proteína está aislado y se utiliza habitualmente en biología molecular como marcador.

ResearchBlogging.orgReferencia: Probing Prokaryotic Social Behaviors with Bacterial “Lobster Traps”Jodi L. Connell,a Aimee K. Wessel,b Matthew R. Parsek,c Andrew D. Ellington,a,d Marvin Whiteley,b,d and Jason B. Sheara,d. Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, Austin, Texas, USAa; Department of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, Austin, Texas, USAb; Department of Microbiology, The University of Washington, Seattle, Washington, USAc; and Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Texas at Austin, Austin, Texas, USA



Por Raven
Publicado el ⌚ 13 diciembre, 2012
Categoría(s): ✓ Biología