El circo grotesco de las células tumorales: enanos contra trapecistas

Por Guillermo Peris Ripollés, el 13 noviembre, 2020. Categoría(s): Biología • Divulgación • Genética
Imagen de la película Freaks (1932) de Tod Browning
Imagen de la película Freaks (1932) de Tod Browning

Este artículo ha sido escrito por Guillermo Peris en colaboración con Pablo Tristán Ramos, primer autor de la publicación científica que en él se describe. Ambos (junto con otros autores) acabamos de publicar un artículo en la revista Nature communications y desarrollado en el Centro Pfizer – Universidad de Granada – Junta de Andalucía de Genómica e Investigación Oncológica (GENYO), tras un gran trabajo liderado por la Dra. Sara R. Heras, que es Co-Investigadora Principal junto al Dr. José Luis García Pérez del grupo de Biología de los Retrotransposones La publicación se titula The tumor suppressor microRNA let-7 inhibits human LINE-1 retrotransposition y puede leerse haciendo clic sobre la siguiente imagen.

En este artículo vamos a intentar contar cuál es el objeto de la investigación publicada y su relevancia. Pese a que se tratará de explicar de forma sencilla los conceptos biológicos necesarios para su comprensión, sería aconsejable leer previamente la serie de artículos que se publicaron en Naukas sobre el circo grotesco de las células tumorales, en la que se empezó hablando de los trapecistas del genoma y se siguió con los enanos. Este artículo, de hecho, sería la tercera y última parte de la serie. Aunque tampoco es imprescindible, también se recomienda ver la charla corta sobre acróbatas del genoma impartida por Guillermo en Naukas Bilbao 2017. De todos modos, para los que quieran limitarse a la lectura de este tercer artículo, se empieza haciendo un resumen de las dos primeras partes.

Retrotransposones: los trapecistas del genoma

La movilización de secuencias del genoma (denominadas elementos móviles o transposones) fue descubierta por Barbara McClintock a finales de los años 40, hallazgo que la hizo valedora del premio Nobel de Medicina en 1983. Si queréis saber más sobre este descubrimiento, podéis ver a Pablo Tristán contándolo en FameLab. La idea de transposición es bastante sencilla de explicar: un fragmento del genoma, una secuencia concreta de nuestro ADN, de repente es capaz de moverse y trasladarse a una posición distinta. Simplificando, un trozo de un cromosoma se traslada a «vivir» a otro cromosoma distinto (o a una posición del mismo distinta de la original).

Fuente

Este movimiento se da en las células de los seres vivos de dos formas distintas: un mecanismo de «corta y pega», en el que la secuencia se «mueve» a otra posición (serían los conocidos como transposones de ADN y el mecanismo básico se observa en la figura sobre este párrafo); y otro mecanismo de «copia y pega», en el que la secuencia crea una copia nueva en una posición distinta del genoma, manteniéndose la secuencia inicial en su posición original (ver la figura siguiente). A estos últimos elementos móviles se les conoce como retrotransposones.

Tanto en el caso de un transposón de ADN como en un retrotransposón, hay un fragmento de ADN que es capaz de «saltar» como un trapecista de una posición del genoma a otra.

Trapecista/transposón a punto de insertarse en una nueva posición del genoma (fuente)

Nos vamos a centrar en los retrotransposones porque son el único tipo de elemento móvil que aún sigue activo en los seres humanos. ¿Por qué reciben ese nombre tan curioso? Recuerda que los retrotransposones se insertan en otra posición del genoma mediante un mecanismo de copia y pega. Para ello crean primero una «plantilla» de la secuencia original de ADN pero utilizando para este propósito una cadena de ARN en la que se transcribe la misma información.

Posteriormente, esa plantilla de ARN se traduce de nuevo a ADN al mismo tiempo que se inserta en otra posición del genoma. Este mecanismo de paso de ARN a ADN es el que utilizan muchos virus de ARN y, por ser en la dirección contraria a la habitual de expresión génica de ADN a ARN (el mecanismo habitual es ADN→ARN→Proteína, mientras que aquí es ARN→ADN), se le conoce como retrotranscripción.

Para este proceso de «copia y pega» los retrotransposones necesitan, como es obvio, «máquinas» que realicen los distintos procesos. En concreto, se requieren enzimas (que no son más que un tipo particular de proteínas que se fabrican con la información almacenada en algún gen) que construyan la nueva cadena de ADN a partir de la plantilla de ARN (conocidas como retrotranscriptasas) y que corten el ADN en la posición en la que se vaya a insertar la nueva copia (endonucleasas). Pues bien, los humanos (y otras especies) tenemos un elemento móvil, un retrotransposón, que además de poder moverse por el genoma contiene la información para construir estas enzimas. A este elemento móvil se le conoce como LINE-1. Aquí tenéis un esquema simple de este retrotransposón:

Los segmentos azules representan los extremos de la secuencia de ADN de LINE-1. Los fragmentos etiquetados como ORF1 y ORF2 contienen la información para fabricar sendas proteínas, que podemos llamar L1-ORF1p y L1-ORF2p. La proteína L1-ORF2p es la encargada de cortar el ADN en la nueva posición de inserción, de retrotranscribir el ARN de la copia a ADN y de insertarlo en el punto de corte. Sí, prácticamente hace toda la faena ella solita.

 

Trapecista
Este señor podría ser un retrotransposón, pero para eso tendría primero que hacer una copia de sí mismo. Alfredo Codona (1928) – (Fuente)

Recapitulemos lo visto hasta ahora. En nuestros genomas hay una secuencia de ADN conocida como LINE-1 que es capaz de realizar copias de sí misma e insertarlas en distintas posiciones del genoma. Cada uno de nosotros presenta en su genoma alrededor de 500000 copias de LINE-1, aunque de ellas solamente entre 80 y 100 son activas (con capacidad de saltar, vaya).

Como podréis imaginar, que estos saltos ocurran puede ser perjudicial. Nuestro genoma contiene la información para construir cada una de nuestras células y si uno de estos trapecistas se mete dentro de un gen puede dar lugar a problemas muy serios (la proteína asociada al gen se podría fabricar mal, por ejemplo). De hecho, se conocen un centenar de casos de enfermedades producidas por un «salto» de un retrotransposón. Pero, por suerte, nuestras células saben cómo defenderse de estos saltos.

Epigenética

Para evitar los saltos de retrotransposones, nuestras células se valen principalmente de la epigenética. Seguro que habéis escuchado alguna vez esta palabra extraña, de moda últimamente como justificación peregrina de terapias inverosímiles. A nosotros nos interesa un aspecto de la epigenética que se conoce como metilación de ADN. La idea no es complicada (os aconsejo que veáis este vídeo de Lluís Montoliu en el que explica con piezas de Tente qué es la metilación de ADN): básicamente, la metilación consiste en la adición en algunas posiciones del genoma de un grupo químico conocido como metilo (-CH3). Este grupo se añade sobre la secuencia de ADN (de ahí el prefijo epi-), por lo que la información almacenada en dicha secuencia no cambia, pero se impide el acceso a las posiciones metiladas de las proteínas que transcriben el ADN a ARN para crear proteínas. Es como si enrolláramos un gen con alambre de espino para evitar que nadie se acercara. Es decir, y simplificando mucho, las secuencias con posiciones metiladas no pueden transmitir información.

Los grupos metilo (CH3) dificultan que se pueda acceder a los genes para expresarlos y fabricar proteínas (fuente).

En las células humanas, la gran mayoría de retrotransposones LINE-1 están metilados, así que resulta difícil acceder a ellos para copiarlos, impidiéndose así la retrotransposición (estos saltos de trapecistas sí ocurren habitualmente en otras células, como células embrionarias o en neuronas, aunque esto no es objeto de este artículo). No obstante, en células tumorales se pierde parte de la estabilidad celular y la metilación del genoma disminuye. Esto hace que algunos LINE-1 que estaban retenidos puedan estar libres para realizar saltos. Hay evidencias de que en células tumorales (sobre todo de tejidos epiteliales) estos saltos ocurren con frecuencia.

Houdini
Harry Houdini silenciado epigenéticamente (fuente).

microARN

Cambiamos ahora de actor celular para hablar sobre microARN. Estas son secuencias de ARN (recordad, parecido al ADN salvo por una base nitrogenada, que cambia timina (T) por uracilo (U), y por ser normalmente de cadena sencilla y no doble, como el ADN y su archiconocida doble hélice) extremadamente pequeñas, sobre todo si las comparamos con el conjunto de nuestro genoma. Para hacernos una idea rápida, si nuestro genoma se escribiera en texto ocuparía el equivalente a 1500 libros de El Quijote, mientras que un microARN no serían más que 3 o 4 palabras: entre 20 y 25 letras.

Al ser tan pequeños, tardaron más en ser descubiertos por los científicos. Pero hoy sabemos que su papel es fundamental en la célula, ya que son capaces de controlar qué proteínas va a fabricar cada tipo de célula distinto. Chiquitines, pero matones.

microARNs, pequeños pero con mucho poder (fuente)

Hay un gran número de microARNs catalogados (del orden de centenares), de muchos de los cuales aún no se conoce su función. Pero uno de ellos destaca por su importante papel celular: es el conocido como let-7. Su nombre deriva de los primeros estudios en gusanos nemátodos C. Elegans, en los que cualquier mutación de esta secuencia daba lugar a terribles malformaciones e incluso la muerte, lo que lo convertía en letal. El let-7 humano consta de 22 nucleótidos que se muestran a continuación:

UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGGUU

Esta secuencia es tan importante en el desarrollo de organismos celulares que apenas ha sufrido cambios en la evolución.

Secuencia del miARN let-7 en el gusano C. elegans, mosca, ratón y humanos (de arriba a abajo). La zona recuadrada indica la secuencia más importante para su función en diferentes miembros de la familia let-7. Imagen adaptada de esta fuente.

¿Cómo actúan los microARN? Creando complejos moleculares con otras proteínas, se unen a los ARN mensajeros (esas copias plantilla que se hacen de los genes y que posteriormente se traducirán a proteínas) de algunos genes, degradándolos para que no se puedan fabricar las proteínas correspondientes. Explicado de forma más simple, sería como si en una enorme cadena de montaje para fabricar coches pusiéramos en un punto intermedio una pequeña pieza metálica que bloqueara un engranaje, evitando la producción de vehículos: el microARN sería esa pequeña pieza.

En esta imagen se representa cómo una secuencia de microARN (en naranja) ligada a complejos celulares (círculos) se une a una hebra de ARN mensajero (rosa) e impide que un ribosoma (violeta) la traduzca a proteína. Imagen modificada de Wikipedia Commons (fuente).

Se sabe que en células tumorales hay un cierto caos que, entre otras cosas, hace que los niveles de microARN varíen respecto a células sanas. Imaginemos que un microARN se encarga de silenciar un gen que, si se expresa, promueve la formación de tumores (oncogen). Si los niveles de este microARN disminuyen, el oncogen puede expresarse e iniciar/empeorar el tumor. Lo mismo ocurre si aumentan los niveles de un microARN que silencia un gen con una acción protectora sobre el cáncer (los denominados genes supresores de tumores).

 

El objeto de nuestra investigación era determinar si alguno de estos microARNs podría controlar los saltos de retrotransposones y, por tanto, si cambios en los niveles de microARNs (como ocurre en muchos tipos de cáncer) podrían resultar en un aumento de «saltos» de estos elementos. Para ello, un primer paso era inspeccionar muestras de tumores y compararlas con las correspondientes células sanas, algo que pudimos hacer gracias al proyecto TCGA.

El atlas de genomas de células cancerígenas

Para estudiar qué sucede en el interior de las células tumorales resulta interesante comparar su genoma, niveles de metilación, expresión génica, así como otros factores, con las células sanas equivalentes. La idea es simple: buscando las diferencias entre una célula sana y una tumoral (del mismo tejido) podremos entender mejor qué ocurre en un cáncer. Con este propósito nació el proyecto The Cancer Genome Atlas (TCGA) el año 2005.  En la base de datos de su web podemos encontrar análisis de células cancerosas y sanas del mismo tejido en pacientes que sufrieron algún tipo de tumor, junto con los correspondientes datos clínicos. Actualmente se cuenta con la información de más de 80000 pacientes explorando un total de 67 tipos de tumores distintos. Esto nos permite analizar directamente las diferencias entre las células sanas y las tumorales de un mismo tejido y una misma persona.

Por ejemplo, en la siguiente figura se muestra la información disponible de un paciente concreto (identificado como TCGA-18-3409) que padeció un carcinoma pulmonar de células escamosas. Alguna  información no está disponible en abierto y requiere de permisos para su acceso, debido a que podrían utilizarse para identificar a la persona concreta: por ejemplo, los datos de la secuenciación del genoma. Otra información, como los datos de epigenética o análisis de ARN mensajero, sí está disponible en abierto.

Enanos contra trapecistas

microARNs preparados para evitar la retrotransposición de LINE-1 (fuente)

La hipótesis que pretendía comprobarse en este estudio (ya apuntada por estudios anteriores) era si algún microARN (enano) era capaz de controlar los saltos de LINE-1 (trapecista) en tumores. Con ese fin, buscamos en TCGA muestras de tumores de pulmón; en concreto, de carcinomas de células escamosas y de adenocarcinomas, tumores en los que se sabe que se producen con más frecuencia saltos de LINE-1. Para estos tumores obtuvimos de TCGA las secuenciaciones completas de sus  genomas, tanto de las células sanas como de las tumorales de pulmón, así como los niveles de distintos tipos de microARN en las células tumorales. Comparando los genomas de células sanas y tumorales podemos comprobar si aparecen nuevas inserciones en el tumor que no estaban en las células sanas. Y, posteriormente, relacionar la presencia o ausencia de estos saltos de LINE-1 con la concentración de distintos tipos de microARN.

Gracias a TCGA podemos comparar células sanas y tumorales de un mismo tumor y paciente (fuente)

La concentración de microARN en las muestras se obtiene directamente de la base de datos TCGA. Para encontrar las nuevas inserciones de LINE-1 en células tumorales respecto a células sanas hicimos uso de un programa que encuentra, en la secuencia de un genoma, nuevas inserciones de distintos elementos móviles (software MELT).

Con este procedimiento encontramos un total de 413 inserciones/saltos de LINE-1 en células tumorales en algunas de las muestras de los 41 individuos analizados. Prácticamente la inmensa totalidad de estos saltos había insertado nuevas secuencias en áreas del genoma en las que no había genes, lo que nos hace pensar que estos saltos no iniciaron el tumor, sino que fueron consecuencia del mismo. Como ya se ha comentado, un salto hacia el interior de un gen podría cambiar las instrucciones para fabricar una proteína y, por tanto, ser responsable de iniciar un tumor. Como ya se ha observado en otras investigaciones, la mayoría de saltos de LINE-1 se insertan en áreas sin genes (lo cual parece normal si consideramos que sólo el 2% del genoma contiene genes).

Al dividir las muestras de pacientes en función de la presencia o ausencia de nuevas inserciones de LINE-1, y comparar entre estos grupos los niveles/abundancia de distintos microRNAs, nos encontramos con esto.

Expliquemos con calma esta figura. Las 41 muestras de pacientes con tumores de pulmón que cumplían los requisitos se dividieron en dos, según se hubieran detectado nuevos saltos de retrotransposones en las células tumorales respecto a las sanas (27 muestras – barras en gris claro) o no (14 muestras – barras en gris oscuro). Para cada uno de estos grupos se analizó la expresión de distintos microARN (si había mucho o poco, vaya). Cada una de las barras de la figura representa la distribución de los valores de microARN en cada grupo de muestras (con/sin inserciones). Las «cajitas» delimitan los puntos en los que se concentran más valores en las muestras y las rayas se extienden para incluir todos los valores (que los estadísticos me perdonen por esta explicación). Si no acabas de entender el gráfico, puedes aprender su uso de forma sencilla aquí.

Si nos fijamos en los tres primeros grupos (let-7a-1, let-7a-2 y let-7a-3, distintos tipos de let-7) se observa que en los grupos en los que se encuentran nuevas inserciones la expresión de estos microARN es claramente más baja (las barras de color claro están significativamente por debajo de las oscuras). El asterisco que aparece en la parte superior de cada grupo indica que esta diferencia es estadísticamente significativa. Además de en el microARN let-7a anteriormente citado, también se observa este comportamiento en let-7e y let-7f-2, así como en el microARN mir-34a.

Dicho de otra forma, podemos ver que cuando una célula tumoral presenta una baja expresión de let-7, la posibilidad de que un retrotransposón LINE-1 se inserte en otra posición del genoma aumenta, lo que nos hace pensar en que el microARN let-7 actúa como protector del genoma evitando saltos de elementos móviles. Es decir, el enano let-7 podría impedir los saltos de trapecistas LINE-1 en células tumorales.

Esta afirmación, pese a ser importante y señalar la conclusión de que let-7 evita retrotransposiciones, presenta un par de problemas. Primero, hay que tener en cuenta que las inserciones que detectamos mediante métodos bioinformáticos son putativas, esto es, posibles inserciones que debemos comprobar a posteriori mediante técnicas bioquímicas experimentales (lo cual no es siempre posible, bien por falta de muestras o por el coste económico de validar estas posibles inserciones). Pero, más importante aún, podría ser que esta correlación aparezca por pura casualidad y no porque realmente let-7 bloquee los saltos de LINE-1 (ya sabéis, correlación no implica causalidad). Para confirmar esta hipótesis debemos dilucidar cuál es el mecanismo molecular por el que se realiza este bloqueo.

Procedimiento experimental

Y aquí es donde entran los biólogos al laboratorio, diseñan experimentos y dedican interminables horas a realizar pruebas. Entre ellos Pablo Tristán, el primer firmante del artículo. De sus experimentos se extrajeron las siguientes conclusiones:

  • Primero, con varios tipos de células en cultivo (entre ellas, las conocidas células HeLa, así como células de cáncer de pulmón) modificadas para detectar los saltos de LINE-1, se observó que let-7 impide los saltos de LINE-1 in vitro: cuando se aumentaba la concentración de let-7 disminuía la retrotransposición de LINE-1, y viceversa.
  • Estos experimentos se repitieron usando células humanas modificadas para generar elementos LINE-1 no humanos (de ratón y pez cebra, concretamente), y las variaciones de let-7 solo afectaron a la movilización de LINE-1 humano. Este y otros resultados obtenidos con técnicas bioquímicas nos indican que hay una interacción entre las secuencias del microARN let-7 y el ARN mensajero de LINE-1 humano.
  • ¿Y a qué parte de la secuencia de LINE-1 (de unos 6000 nucleótidos de longitud) se fija let-7? Pues mediante un análisis bioinformático (realizado por Alejandro Rubio) seguido de una comprobación experimental, se comprobó que let-7 se aparea con un fragmento de la región ORF2 de LINE-1 (que produce la proteína L1-ORF2p, encargada de cortar el genoma en el punto de inserción y pasar de ARN a ADN).
  • El efecto que tiene esta unión de let-7 al ARN mensajero de LINE-1 es que se dificulta la traducción de L1-ORF2p, es decir, se reduce la fabricación de la enzima responsable de generar nuevas copias de LINE-1 en el genoma.
Posible punto de apareamiento entre LINE-1 y let-7.

Conclusión

Este trabajo, que podría encuadrarse en lo que denominamos «investigación básica» (lo siento, no hemos encontrado la cura para el cáncer, pero sí ayuda a entenderlo un poco mejor) hemos descubierto un nuevo papel del microRNA let-7: mantener la integridad del genoma evitando las retrotransposiciones de LINE-1. Para ello nos hemos servido de análisis bioinformático de genomas y expresión de microARN obtenidos de la base de datos TCGA, que nos brinda la posibilidad de comparar células sanas y tumores del mismo tejido y personas. También se ha llevado a cabo un estudio experimental que ha permitido localizar en la secuencia de LINE-1 la posición en la que se fija let-7 para evitar sus saltos, así como describir el mecanismo molecular por el que se produce esta regulación.

Una baja expresión de este «enano» celular puede conllevar un aumento de la actividad de los «trapecistas» LINE-1 y empeorar el desarrollo de un tumor. Así, y pese a que no es habitual que el salto de un elemento móvil inicie un tumor, sí que es posible que los saltos una vez iniciado el cáncer aumenten su malignidad.

A título personal, Guillermo quiere agradecer al grupo de Biología de retrotransposones de Genyo la acogida recibida desde el primer día, la formación recibida y las maravillosas reuniones (esos loving-beers) disfrutadas con el grupo.

Referencia

The tumor suppressor microRNA let-7 inhibits human LINE-1 retrotransposition, Pablo Tristán-Ramos, Alejandro Rubio-Roldan, Guillermo Peris, Laura Sánchez, Suyapa Amador-Cubero, Sebastien Viollet, Gael Cristofari y Sara R. Heras. Nature Communication 11, 5712 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-19430-4