CRISPR y la Yenka

Desde la izquierda: Feng Zhang, David Liu y J. Keith Joung, fundadores de Beam Therapeutics (fotografía Endpoints News).

En 1964 el dúo musical formado por Johnny and Charlie lanzó una canción simplona, repetitiva y pegadiza que triunfó y todavía hoy es momento obligado en cualquier fiesta vintage que se precie. La Yenka implícitamente nos recordaba lo difícil que es avanzar con esos saltitos a izquierda, derecha, adelante y atrás.

De igual manera la evolución de las herramientas CRISPR progresa, como la Yenka, con pasos adelante y atrás. Cuando parece que hemos avanzado substancialmente alguien, en algun lugar del mundo, reporta unos estudios que echan un nuevo jarro de agua fría y nos recuerda humildemente nuestra esencial ignorancia del sistema CRISPR, en cualquiera de sus variantes. Y la necesidad de seguir investigando los fundamentos básicos de estas maravillosas herramientas de edición genética.

David Liu sorprendió al universo CRISPR en 2016 con su propuesta innovadora que denominó editores de bases (BE), una especie de tippex molecular, capaz de cambiar una letra por otra en el genoma sin necesidad de cortar el ADN y provocar su reparación. En realidad, los BE eran una evolución derivada de la dead Cas9 (dCa9), la nucleasa muerta, que, recordemos, no corta el ADN pero sí aprovecha la especificidad de unión específica a un gen que le proporciona la guía de ARN. A Liu se le ocurrió asociar la dCas9 a una nueva actividad enzimática, al enzima citidina deaminasa, que permitía modificar, in situ,  una C por una T a través de U, aprovechando la transformación química directa de la base nitrogenada. Alucinante. Los editores de bases han sido tan sorprendentes y relevantes que merecieron una de las palabras del título de mi libro Editando genes: recorta, pega y colorea. En efecto, colorear es la acción que realizan los BE, al cambiar el «color» de la letra de forma directa. Y esto lo hacían sin necesidad de «cortar» el ADN, consiguiendo con ello contener la habitual diversidad de variantes genéticas (mosaicismo genético) que se generaban tras cualquier experimento con CRISPR, producto de la reparación azarosa de los cortes específicos en el ADN que realizaba la proteína Cas9.

¿Cómo funcionan los editores de bases? En este gráfico se ilustra como funciona un editor de bases asociado a una actividad citidina deaminasa. (1) En primer lugar se localiza la C que quiere transformarse en una C. (2) La actividad citidina deaminasa del editor de bases BE3 convierte la C en una U (que no es una base del ADN sino del ARN, y es análoga a la T). (3) Se promueve la corrección de la cadena complementaria para aparear la U (que es reconocida como una T) y cambiar la G inicial por una A. (4) Finalmente la A de la cadena complementaria ahora dirige la inclusión de una T en la cadena inicial, consiguiéndose el cambio deseado de C por T. Gráfico: Lluís Montoliu.

El laboratorio de Liu siguió trabajando en optimizar los BE y en 2017 mejoró la propuesta desarrollando la tercera versión (BE3) que ya era un poco más compleja e incorporaba otras actividades enzimáticas en una proteína quimérica compleja y multifuncional. Ya no era estríctamente cierto que los BE no «cortaban» el ADN puesto que BE3 incorporaba dos actividades más. En primer lugar, una proteína inhibidora de la uracilo ADN glicosilasa (UDG), para impedir que la uridina (U) introducida por la citidina deaminasa fuera eliminada y retornara a la letra C inicial al enfrentarse erróneamente a una G en la otra cadena.  La variante BE3 también incorporaba una restauración parcial de la capacidad de corte de la dCas9, capaz de volver a cortar una de las dos cadenas del ADN, la cadena contraria a la C que quiere modificarse, promoviendo así su reparación y que la U de la cadena complementaria fuera confundida con una T y entonces promover la substitución de la G inicial por una A. Ambas modificaciones para impedir que los sistemas de corrección eliminaran el cambio de la C por la U y, por el contrario, interpretaran esa U como T e insertaran una A en la cadena contraria y finalmente, en la siguiente ronda de replicación/reparación, una T en lugar de la C original. Estas actividades adicionales presentes en BE3 frecuentemente se olvidan al presentar, erróneamente, los BE como la solución al mosaicismo genético, puesto que sí siguen cortando el ADN, al menos en una de las cadenas. Liu y otros se dieron cuenta de que BE3 permitía reducir los INDELs (inserciones y deleciones al azar) asociados a cualquier actividad CRISPR pero constató, muy a su pesar, que los niveles de mutaciones off-target (las mutaciones en secuencias similares del genoma) eran peligrosamente elevados, con porcentajes de dos cifras. Por eso desarrolló la HF-BE3 incrementando la especificidad de la parte dCas9 y, con ello, reduciendo los niveles de mutaciones no deseadas en secuencias genómicas similares (disminuyendo las problemáticas secuencias off-target). Quienes estéis interesados en todos estos detalles de los BE los explico en uno de los capítulos de mi libro de «Editando genes: recorta, pega y colorea«.

Naturalmente los BE generaron un enorme interés en el mundo CRISPR y dispararon las expectativas terapéuticas (muchas de las enfermedades congénitas están causadas por mutaciones puntuales, en donde solo una sola letra cambia, fácilmente corregibles mediante el uso de editores de bases), incluida la creación de la empresa Beam Therapeutics, promovida por David Liu, Feng Zhang y J Keith Joung.

La semana pasada, el jueves 28 de febrero, dos artículos de dos equipos independientes de investigadores chinos, en Shanghai, publicados en la prestigiosa revista Science, venían a despertarnos del sueño y las expectativas terapéuticas asociadas a los BE al reportar cantidades muy significativas de mutaciones off-target en dos sistemas experimentales muy distintos, en experimentos realizados en el arroz y en el ratón, en los que el uso de la variante BE3 había provocado numerosas mutaciones en múltiples sitios no deseados, distintos del inicialmente previsto.

En ambos estudios reportan porcentajes de mutaciones off-target cuando usaban los editores de base asociados a citosina deaminasa (que promueve el cambio de C->T) hasta 20 veces superiores a los que se observan con la Cas9 nativa (que tiene ya muy pocos off-target de por sí) o con la dCas9 asociada al otro tipo de editores de bases asociados a la actividad enzimática adenina deaminasa (ABE), que promueve el cambio de A->G. Estos resultados, muy preocupantes, recomiendan una revisión urgente de las expectativas generadas con estos BE, especialmente en aquellas aplicaciones y usos enfocados a biomedicina y tratamientos, que ahora parecen todavía más lejanos y deberían ser prudentemente congelados.

David Liu, inteligentemente, discute que los errores encontrados asociados al uso de citosinas deaminasas siguen siendo poco frecuentes y que, en general, no serán un problema para el uso académico de los BE (como muchos hemos venido diciendo más genéricamente hablando de las herramientas CRISPR en general, para su uso en los laboratorios). El que los BE aparezcan asociados a frecuentes off-target puede resolverse fácilmente en animales y plantas, en actividades académicas, mediante cruces y segregación alélica, seleccionando aquellos individuos que han heredado las mutaciones correctas y desechando los que hayan incorporado mutaciones off-target adicionales. Totalmente de acuerdo con Liu. Ahora bien, esto no es posible en seres humanos. Por eso, la publicación de estos nuevos hallazgos bloquea de facto el uso inmediato de estas nuevas herramientas BE en terapia. Los editores de bases no deberían usarse en tratamientos hasta que su especificidad no aumentara considerablemente y, consecuentemente, se lograra disminuir significativamente el riesgo de mutaciones no desadas en secuencias genómicas similares.

Una Yenka en toda regla. Volvemos a la casilla inicial. Se requiere más ciencia e investigación básica para aumentar nuestro conocimiento de los BE para que eventualmente, en algún momento, pueda considerarse su uso terapéutico.

 



Por Lluis Montoliu
Publicado el ⌚ 4 marzo, 2019
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